Nghiên cứu bào chế cao lỏng từ bài thuốc cổ truyền tiểu sài hồ thang làm thuốc điều trị hạ sốt hàn nhiệt

1. Đặt vấn đề:

Thuốc hạ nhiệt chữa sốt từ dược liệu có ưu điểm không có tác dụng phụ. Thang thuốc tiểu sài hồ có hiệu quả điều trị tốt trong các chứng sốt hàn nhiệt. Tuy nhiên thang thuốc phải sắc để uống, không thuận tiện, cần được chuyển dạng thành cao lỏng để pha siro nhằm đảm bảo chất lượng, hiệu lực của thuốc cũng như thuận tiện sử dụng.

2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

2.1. Đối tượng nghiên cứu:

Các dược liệu có thành phần cho thang thuốc tiểu sài hồ được chiết suất để bào chế cao lỏng: sài hồ 20g; hoàng cầm 7,8g; bán hạ 7,8g; nhân sâm 7,8g; sinh khương 7,8g; cam thảo 7,8g; đại táo 1 quả. Các dược liệu được kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt nam VI.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

Chiết suất các hoạt chất trong thang thuốc bằng phương pháp sắc: thời gian sắc lần 1 -120 phút, lần 2 – 80 phút, lần 3 – 60 phút, tỷ lệ dược liệu : dung môi là 2 : 10.

Cô cách thủy dịch chiết thu được trong 8 giờ, loại tạp trong cao lỏng 2 : 1 bằng ethanol 96% đồng lượng sau đó cô tiếp đến thể chất cao lỏng 6 : 1 (10 gram cao tương ứng 60 gram dược liệu của một thang thuốc).

Định tính dược liệu sài hồ, hoàng cầm trong cao bằng sắc ký lớp mỏng.

Định lượng baicalin và saikosaponin trong cao bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận:

3.1. Cách tiến hành:

Định tính baicalin trong cao lỏng, so sánh với chất chuẩn: lấy 5 gram cao lỏng vào cốc có mỏ, cô cách thủy đến cạn, sau đó thêm 30ml hỗn hợp dung dịch ethyl acetat : methanol (3 : 1) khuấy đều, lọc, cô cách thủy đến cạn. Hòa tan cắn bằng 5ml methanol. Thu được dịch chiết chấm sắc ký. Chất chuẩn baicalin hòa tan trong methanol (tỷ lệ 0,5 %) để chấm sắc ký.

Bản mỏng silicagel 60 F₂₅₄  được hoạt hóa ở 110^oC trong 1 giờ, dung môi khai triển: toluen – ethyl acetat – methanol – acid formic  (tỷ lệ 10 : 3 : 1 : 2) hiện mầu bằng dung dịch FeCl₃ 1% trong ethanol chấm sấy bản mỏng ở 105^oC cho đến khi hiện rõ vết. Kết quả thu được sắc ký đồ cao lỏng có chứa baicalin tương ứng với chất chuẩn.

Định tính saikosaponin trong cao lỏng, so sánh với chất chuẩn: Lấy 5 gram cao lỏng vào cốc có mỏ, cô cách thủy đến cạn, thêm 30 ml dung dịch ethyl acetat : methanol (3 : 1) siêu âm trong 30 phút sau đó đem lọc, cô dịch lọc cách thủy, hòa tan cắn bằng 5 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký. Saikosaponin A hòa tan trong methanol (tỷ lệ 0,5 %) để chấm sắc ký. Baicalin hòa tan trong methanol (tỷ lệ 0,5 %) để chấm sắc ký.

Bản mỏng cilicagel 60 F₂₅₄  được hoạt hóa ở 110^oC trong 1 giờ, dung môi khai triển: toluen – ethyl acetat – methanol – acid formic  (tỷ lệ 10 : 3 : 1 : 2) hiện mầu bằng p- dimethylaminobenzaldehyd 2% trong acid sulfuric 40%. Sấy bản mỏng ở 60^OC cho tới khi xuất hiện vết. Kết quả thu được sắc ký đồ cao lỏng có chứa saikosaponin A tương ứng với chất chuẩn .

Định lượng baicalin trong cao lỏng: pha các dung dịch chuẩn từ baicalin chuẩn tinh khiết trên 98%, nồng độ 10 : 20 : 25 : 37,5 phần triệu trong dung dịch ethanol. Pha dung dịch mẫu thử: cân 2,1079 gram cao tổng hợp cho vào bình nút mài, thêm ethanol 70%, đun hồi lưu trên cách thủy trong 3 giờ, để nguội, lọc vào bình định mức 100 ml, tráng rửa bình nón và cắn 3 lần bằng ethanol 70% mỗi lần 10 ml, gộp dịch rửa thêm cho đủ đến vạch 100 ml. Lấy chính xác 1 ml dung dịch trên vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, trộn đều, lọc qua màng 0,45 micromet thu được dung dịch mẫu thử.

Tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao trên thiết bị HPLC (Jasco, Nhật Bản – detector UV 4070, dùng phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu). Cột sắc ký CO – 4060 (180mm x 4,6mm, 5micromet). Bước sóng 280 nanomet. Tốc độ dòng 1 – 2 ml/phút, thể tích tiêm 10 microlit.

Đường chuẩn của Baicalin thu được có phương trình hồi quy tuyến tính:

y = 10,979,096,97384x – 10,493.01181 với hệ số tương quan R² = 0,99846.

Tư liệu thực nghiệm được ghi trong Bảng 1.

Bảng 1. Kết quả trên thiết bị HPLC phân tích baicalin trong mẫu chuẩn và mẫu thử

Định lượng Saikoponin A trong cao lỏng: pha các dung dịch chuẩn từ saikosaponin A chuẩn tinh khiết trên 98%, nồng độ 20 : 50 : 100 : 300 phần triệu trong dung dịch methanol. Pha dung dịch mẫu thử: cân 2,0082 gram cao tổng hợp cho vào nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch amoni hydrocid trong methanol (trộn 1 thể tích dung dịch 25% với 4 thể tích methanol). Siêu âm trong 30 phút. Li tâm 3200 vòng/phút trong 10 phút. Lấy lớp dịch trên, bã dược liệu được chiết thêm 2 lần. Rửa bình và bã dược liệu bằng 15 ml methanol. Gộp dịch lọc và dịch rửa, cất thu hồi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn trong methanol vừa đủ 5 ml, lọc qua màng 0,45 micromet thu được mẫu thử.

Tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao trên thiết bị HPLC (Jasco, Nhật Bản – detector UV 4070, dùng phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số liệu). Bước sóng 210 nanomet. Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20 microlit.

Đường chuẩn của saikosaponin thu được có phương trình hồi quy tuyến tính:

y = 2,189.71613x + 7,051.18930 với hệ số tương quan R² = 0,99954.

Tư liệu thực nghiệm được ghi trong Bảng 2.

Bảng 2. Kết quả trên thiết bị HPLC phân tích saikosaponin trong mẫu chuẩn và mẫu thử

3.2. Kết quả nghiên cứu:

Từ nồng độ, diện tích peak và đường chuẩn tính ra được hàm lượng dược chất trong cao lỏng như sau: hàm lượng baicalin là 0,03832%, hàm lượng saikosaponin A là 0,01024047%.

Từ cao lỏng 2 : 1 thu được đã pha chế siro với 11 công thức khác nhau. Đã chọn công thức có thành phần như sau để bào chế siro thuốc chữa sốt: cao lỏng tiểu sài hồ 20ml, natri carboxy methylcelluloce 0,8 gram, nipagin 0,16 gram, saccarin 0,16 gram, ethanol 96% 1,6 ml.

3.3. Bàn luận:

Hàm lượng 2 nhóm hoạt chất baicalin và saikosaponin trong cao thu được ít hơn tính theo dược liệu ban đầu do ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trong quá trình sắc thuốc và có thể do hoạt chất tạo phức với các thành phần khác trong hỗn hợp dịch chiết toàn phần. Cao lỏng nghiên cứu bào chế được có hàm lượng hoạt chất định chuẩn đảm bảo chất lượng và hiệu lực thuốc khi sử dụng so với việc sắc thang thuốc tiểu sài hồ.

4. Kết luận:

Đã bào chế được cao lỏng 6:1 từ thang thuốc đông dược tiểu sài hồ (1 gram cao lỏng tương ứng 60 gram dược liệu của 1 thang thuốc). Đã định tính và định lượng được baicalin và saikosaponin trong cao lỏng nhằm chuẩn hóa cao thuốc. Từ cao thuốc đã pha chế được siro thuốc có công thức thích hợp dùng để điều trị chứng sốt hàn nhiệt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V.
2. Đỗ Tất Lợi (2006), Cây thuốc và những vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội.
3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học, Hà Nội.
4. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam Tập I, II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội
5. Trương Trọng Cảnh, Thương hàn luận, NXB Đồng Nai (1996).
6. Bart H. J. and Pilz S ( 2011 ). Industial Scale Natural Products Extraction, 1 st ed, Wiley – VCH Verlag GmbH & Co. KgaA.
7. Handa S. S. et al. ( 2008 ). Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plant, ICS UNIDO, Trieste.
8. Sarker S. D. et al ( 2005 ). Natural Products Isolation, 2 nd ed, Humana Press Inc, Totowa, New Jersey.