Nghiên cứu định lượng Puerin trong rễ củ sẵn dây bằng phương pháo HPLC

TÓM TẮT:

Puerarin là thành phần chính có trong rễ củ Sắn dây (Radix Puerariae thomsonii), một dược liệu có tác dụng tốt trong điều trị bệnh tim mạch, chống oxy hóa và chống lạm dụng rượu. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây; ứng dụng phương pháp để đánh giá hàm lượng puerarin trong một số mẫu dược liệu trên thị trường. Điều kiện sắc ký được xác định gồm cột Ascentis^® RP C18 (250 x 4,6mm; 5μm), bước sóng phát hiện 250nm; tốc độ dòng 1ml/phút, pha động methanol : nước (25:75). Phương pháp định lượng đảm bảo tính chọn lọc, khoảng tuyến tính từ 0,5 đến 50μg/ml (r=0,9998), độ đúng cao (96,7 đến 103,65%, RSD < 2%), độ lặp lại tốt (RSD<2%). Hàm lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây từ 0,014% đến 0,762% tính theo khối lượng khô.

Từ khóa: Puerarin, Sắn dây

SUMMARY

Puerarin is the major bioactive ingredient in the roots of Kudzu (Radix Puerariae thomsonii), a traditional herbal that has good effects in the treatment of cardiovascular disease, antioxidants and alcohol abuse. This study was performed to develop and validate the method of quantifying puerarin in Kudzu roots; The method was applied to assay the content of puerarin in some pharmaceutical samples on the market. Chromatographic conditions were determined including Ascentis® RP C18 column (250 x 4.6mm; 5μm), detection wavelength of 250nm; 1ml/min flow rate, mobile phase methanol:water (25:75). The method was validated for the specificity, linearity ranging from 0.5 to 50μg/ml (r = 0.9998), accuracy (recovery: 96.7 to 103.65%, RSD <2%), repeatability good return (RSD <2%). The content of puerarin in roots of kudzu ranges from 0.014% to 0.762% on the dry weight.

Key words: Puerarin, Kudzu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Puerarin, còn được gọi là Kakonein, là một isoflavonoid có liên kết C-glycosid. Nó là hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ 3-phenylchromen-4-one. Puerarin có tính acid yếu, ít tan trong nước. Trong tự nhiên, Puerarin được tìm thấy trong một số loại cây và thảo mộc, chẳng hạn như rễ củ cây Sắn dây. Nó cũng là một trong các isoflavonid chính có trong rễ củ Sắn dây[1]. Các nghiên cứu đến nay chỉ ra nó tác dụng tốt trong bảo vệ tim mạch[3], [4], chống oxy hóa[5], tác dụng kiểu phytoestrogen[6] và hạn chế tác tác hại của nghiện rượu[7] … Trong dược điển Trung Quốc 2015[2] và tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông Trung Quốc[8], hàm lượng puerarin là một trong các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng Cát căn (tên vị thuốc làm từ rễ củ Sắn dây) và đây cũng là sự khác biệt rõ ràng nhất giữa tiêu chuẩn chất lượng của hai loài Pueraria thomsonii và Pueraria lobata. Ở Việt Nam, việc phân biệt các loài Sắn dây còn chưa được quan tâm và các nghiên cứu về puerarin còn hạn chế. Nhằm đóng góp cho công tác đánh giá, kiểm tra chất lượng vị thuốc Cát căn và góp phần cho chuyên luận Sắn dây trong dược điển Việt Nam tiếp theo, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

Rễ củ sắn dây tươi thu hái vào thời điểm một năm tuổi, Sắn dây được loại bỏ đất cát, rửa sạch, thái lát mỏng khoảng 2-3 mm, sấy đến khô ở 60 ˚C. Sau đó nghiền nhỏ đến kích thước dưới 1mm, bảo quản trong túi nilon kín.

Mẫu Sắn dây khô (Cát căn) được thu mua ngẫu nhiên ở một nhà thuốc y học cổ truyền ở Hà Nội. Mẫu Cát căn được nghiền nhỏ đến kích thước dưới 1mm, bảo quản trong túi nilon kín.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Điều kiện sắc ký

– Cột RP C18 Ascentis^® (250 x 4,6 mm; 5μm); pha động: Methanol – nước (25:75) (tt/tt); detector UV phát hiện ở bước sóng 250nm; tốc độ dòng: 1,0ml/phút; thể tích mẫu tiêm: 20μl.

2.2. Chuẩn bị dung dịch phân tích

– Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25mg Puerarin (chất chuẩn) vào bình định mức 50ml. Hòa tan và thêm vừa đủ bằng ethanol, lắc đều. Lấy 2,0ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50ml, thêm ethanol 30 % đến vừa đủ, lắc đều được dung dịch chuẩn có nồng độ 20μg/ml.

– Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,2 g bột củ Sắn dây (mẫu thử) vào bình định mức 50ml. Thêm 40ml ethanol 30 %, siêu âm 15 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng, bổ sung cùng dung môi đến vạch, lắc đều. Để lắng và lọc qua màng 0,45 µm để được dung dịch tiêm sắc ký.

Tiêm riêng biệt 20μl mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả. So sánh diện tích pic xác định trên sắc đồ để xác định hàm lượng puerarin trong mẫu thử. Hàm lượng (%) puerarin (C_21­H₂₀O₉), trên khối lượng khô được tính theo công thức:

Trong đó:

m_t, m_s : là khối lượng thử tính theo khối lượng khô và khối lượng puerarin chuẩn (mg)

S_s, S_t    : là diện tích pic puerarin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử

2.3. Thẩm định phương pháp định lượng:

Thẩm định các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian.

2.4 Thực nghiệm

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ

– Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao JASCO (Nhật Bản) với bơm PU-4180, buồng điều nhiệt CO-4060, detector UV-4070. Cân phân tích Sartorius 1523-S (Đức) có độ chính xác 0,1mg. Các dụng cụ thủy tinh cần thiết cho quá trình thực nghiệm.

2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn

– Chất chuẩn Puerarin (C_21­H₂₀O₉) (Nguồn gốc: Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.; Hàm lượng:  99,2 % nguyên trạng);

– Methanol (HPLC; Merck); Nước cất (TCCS)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1. Độ đặc hiệu

Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt dung môi pha mẫu, dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Kết quả phân tích được thể hiện trong hình

Hình 1. Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu

Hình 2. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn

Hình 3. Sắc ký đồ của dung dịch thử

Kết quả hình 1, 2, 3 cho thấy trên sắc ký đồ dung dịch thử có pic tương ứng tại thời gian lưu của pic puerarin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Pic puerarin có hình dáng cân đối, hệ số đối xứng khoảng 0,95; tách rõ ràng với các pic lân cận trên sắc ký đồ dung dịch thử. Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu, không quan sát thấy pic tại thời gian lưu của puerarin. Các kết quả này cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về tính đặc hiệu.

2. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 20μg/ml. Ghi lại các sắc ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic puerarin. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1.

Bảng 1. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Kết quả Bảng 1 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu nhỏ hơn 1%. RSD của diện tích pic và hệ số đối xứng không quá 2%. Như vậy, hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng puerarin trong rễ của Sắn dây.

3. Độ tuyến tính

Khảo sát trên dãy dung dịch chuẩn puerarin pha trong ethanol 30% với các nồng độ khác nhau. Cân 25,6mg puerarin (chất chuẩn) vào bình định mức 50ml. Hòa tan và thêm vừa đủ bằng ethanol 30% được dung dịch chuẩn gốc (A) có nồng độ 500μg/ml. Từ dung dịch A pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn, cách chuẩn bị và kết quả được thể hiện trong Bảng 2 và Hình 4.

Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Hình 4. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ puerarin

Kết quả Bảng 2 và Hình 4 cho thấy với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ puerarin với hệ số tương quan r=0,9998.

4. Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn bị như mô tả ở mục 2.2.2.2.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc thêm vào độ đúng (B): Từ dung dịch chuẩn gốc (A) 500 µg/ml (mục 3.3. Độ tuyến tính), lấy 5,0 ml dung dịch A vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung dịch EtOH 30 % đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch B có nồng độ 250 µg/ml.

Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn: Các dung dịch thử thêm chuẩn có nồng độ lần lượt bằng 75%, 100%, 125% so với nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ chuẩn bị 3 mẫu. tiến hành song song với dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Kết quả khảo sát độ đúng được thể hiện trong Bảng 3.

Kết quả tính theo dung dịch chuẩn tiến hành song song có diện tích pic puerarin 499046 mAU.s. Số liệu Bảng 3 cho thấy tỉ lệ thu hồi puerarin từ 96,70% đến 103,65% (nằm trong giới hạn từ 92-105%) và RSD nhỏ hơn 2%. Như vậy phương pháp phân tích có độ đúng tốt.

5. Độ chính xác

5.1. Độ lặp lại

Tiến hành định lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây trên 6 mẫu thử tiến hnahf độc lập được chuẩn bị như mục 2.2.2.2. Kết quả trình bày ở Bảng 4 cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với RSD là 1,52% (nhỏ hơn 2%).

5.2. Độ chính xác trung gian

Kiểm nghiệm viên (KNV) 2 tiến hành định lượng puerarin trên cùng mẫu thử vào một ngày khác. Các tiến hành như phần độ lặp lại. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.

Bảng 4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

Kết quả Bảng 4 cho thấy phương pháp định lượng puerarin có độ chính xác cao, phù hợp với độ lặp lại trong ngày là 1,91% và 1,52% (n=6), độ lặp lại khác ngày là 1,70% (n=12).

6. Kết quả định lượng puerarin trong một số mẫu dược liệu

Phương pháp đã xây dựng và thẩm định được ứng dụng để định lượng puerarin trong một số mẫu rễ củ Sắn dây tự thu hái hoặc mẫu Cát căn đang lưu hành trên thị trường. Kết quả định lượng định lượng được thể hiện trong Bảng 5.

Bảng 5. Hàm lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây tính theo khối lượng khô

Kết quả Bảng 5 cho thấy: Các mẫu phân tích có hàm lượng puerarin từ 0,014% đến 0,762% tính theo khối lượng khô. Hàm lượng dao động trong khoảng rộng, mẫu có hàm lượng cao nhất so với mẫu thấp nhất chênh lệch hơn 50 lần. Vì vậy, định lượng lượng puerarin là chỉ tiêu cần thiết để đánh giá chất lượng dược liệu này.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu đã đề xuất được phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây. Phương pháp sử dụng cột  Cột RP C18 Ascentis^® (250 x 4,6 mm; 5μm); tốc độ dòng 1,0ml/phút; thể tích tiêm 20μl. Pha động là methanol:nước (25:75); detector UV cài đặt ở bước sóng 250nm. Phương pháp đã được thẩm định về tính đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp HPLC đã xây dựng đủ tin cậy và phù hợp để định lượng puerarin trong rễ củ Sắn dây. Kết quả định lượng cho thấy rễ củ Sắn dây có chứa puerarin với hàm lượng từ 0,014% đến 0,762% tính theo khối lượng khô.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chen TR, Chen LA, Wei QK (2010), “Evaluation of quality of Radix Puerariae herbal medicine by isoflavonoids”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 62, 644-650.
2. China Food and Drug Administration (2015), “Pharmacopoeia of the people’s republic of China”, China Medical Science Pass, IA, pp. 380-381.
3. Gao Q, Pan HY, Qiu S et al. (2006), “Atractyloside and 5-hydroxydecanoate block the protective effect of puerarin in isolated rat”, Life Sci, 79, pp. 217–224.
4. Guo XG, Chen JZ, Zhang X, Xia Q. (2004), “Effect of puerarin on L-type calcium channel in isolated rat ventricular myocytes”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 29, pp. 248–251.
5. Zhu QL, He AX, Han HR et al. (2002), “The potential effect of puerarin in preventing atherosclerosis”, CJIM, 8, pp. 290-294.
6. Malaivijitnond S, Tungmunnithum D, Gittarasanee S et al. (2010), “Puerarin exhibits weak estrogenic activity in female rats”, Fitoterapia, 81, pp. 569-576.
7. Yan-Xi Z., et al. (2014), “Puerarin: A review of Pharmacological Effects” Phytotherapy Rerearch, 28, pp. 965-967.
8. Chinese Medicine Division Department of health (2017), “Hong Kong Chinese Materia Medica Standards (HKCMMS) Office”, 3, pp. 215-233